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技術(shù)文獻

常見的BCA法檢測蛋白定量實驗步驟
閱讀次數(shù):19 發(fā)布時間:2025/3/7 9:39:14
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一、簡介

BCA(Bicinchoninic Acid)法是一種常用的蛋白定量檢測方法,其原理是利用蛋白質(zhì)與銅離子在堿性溶液中發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),生成穩(wěn)定的紫紅色復(fù)合物,再與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,即可求出待測蛋白的濃度。該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡便、抗干擾能力強等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)等域。

二、實驗步驟

1.試劑準(zhǔn)備

(1)BCA工作液:將BCA試劑A和B按50:1的比例混合,充分搖勻,備用。

(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液:取適量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白,用PBS或去離子水溶解,配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。

2.蛋白樣品制備

(1)細胞裂解:將細胞樣品離心,去除上清液,加入適量的細胞裂解液,在冰上裂解30min,使細胞充分裂解。

(2)去除雜質(zhì):將裂解后的樣品離心,去除沉淀,保留上清液。在上清液中加入適量的SDS,使終濃度為0.1%,充分混勻。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:取適量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,加入適量的SDS,使終濃度為0.1%,然后分別稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。取96孔板,分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。在每個孔中加入BCA工作液,充分混勻。然后按照說明書要求,在特定波長下測量吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.蛋白定量檢測

(1)取適量的待測蛋白樣品,加入適量的SDS,使終濃度為0.1%,充分混勻。然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法,加入BCA工作液,測量吸光度值。

(2)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,查找出待測蛋白樣品的濃度。如果待測蛋白樣品濃度較高,可以進行適當(dāng)稀釋后再進行測定。

三、注意事項

1.BCA工作液應(yīng)儲存于4℃避光保存,避免反復(fù)凍融。

2.實驗過程中應(yīng)保持樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的pH值一致,以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.在實驗過程中應(yīng)避免交叉污染,以免影響實驗結(jié)果。

4.對于一些特殊的蛋白質(zhì)樣品,可能需要采用其他方法進行定量檢測。

原創(chuàng)作者:上海遠慕生物科技有限公司

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